Τα πρώτα χρόνια του πελοποννησιακού πολέμου η Χίος παρέμεινε πιστή σύμμαχος των Αθηναίων. Χαρακτηριστικοί οι στίχοι του Ευπόλιδος στο θεατρικό έργο του ‘Πόλεις’, το οποίο ανέβηκε στο Αθηναϊκό θέατρο και ήταν γραμμένο γύρω στο  420 π.Χ., αναφέροντας για τη σχέση της Χίου και της Αθήνας : «Η Χίος η ωραία πόλη, που μας στέλνει πολεμικά πλοία και άνδρες, όταν χρειαστεί, αλλά και γενικά πειθαρχεί χωρίς πρόβλημα , όπως ένα άλογο χωρίς να το χτυπάει κανείς».
Η πρώτη πολεμική επιχείρηση στην οποία συμμετείχε το ναυτικό της Χίου ήταν στην εκστρατεία του Περικλή στην Αργολίδα(περίπου το 430 π.Χ.), όπου η Χίος και η Λέσβος έστειλαν 50 τριήρεις. Το 425 π.Χ. τέσσερα χιακά πλοία βοήθησαν τους Αθηναίους στη νικηφόρο εκστρατεία της Πύλου και το 423 π.Χ. δέκα πλοία της Χίου ενίσχυσαν το στόλο του Νικία στη Χαλκιδική. Η επόμενη συμμετοχή χιακών πλοίων ήταν στην εκστρατεία των Αθηναίων κατά της Δωρικής Μήλου (416 π.Χ.) , η οποία καταστράφηκε από τους Αθηναίους.
Κατά την εκστρατεία των Αθηναίων στη Σικελία(415 π.χ.) οι Χιώτες και οι Μυτιληνιοί έστειλαν περίπου 55 πλοία για βοήθεια. Οι Αθηναίοι διαπίστωσαν ότι δεν μπορούσαν να καταλάβουν τις Συρακούσες και αποφάσισαν να επιστρέψουν στην Ελλάδα. Μάταια όμως γιατί τους απέκλεισαν την έξοδο του Μεγάλου Λιμανιού  οι Συρακούσιοι. Έτσι εγκατέλειψαν τα  πλοία τους και μπήκαν στη στεριά. Εκεί τους συνέλαβαν οι Συρακούσιοι και τους περισσότερους τους έριξαν στα Λατομεία και μετά από 70 μέρες τους πούλησαν για δούλους. Ελάχιστοι Χιώτες επέζησαν απ’ αυτή τη δοκιμασία, για να φέρουν και τα δυσάρεστα νέα στην πατρίδα τους.
Μετά την Εκστρατεία στη Σικελία η Αθήνα είχε πλέον χάσει τη μεγάλη δύναμή της και άρχισε να χάνει και τους συμμάχους της. Έτσι και η Χίος το 412 π.Χ. ήταν από τους πρώτους συμμάχους που εγκατέλειψαν τη συμμαχία μετά από 66 χρόνια συνεχούς και πιστής παραμονής στην Αθηναϊκή συμμαχία. Οι Αθηναίοι θορυβήθηκαν πολύ από την αποστασία της Χίου , της δυνατότερης πόλης από τους συμμάχους της στην Ιωνία. Έτσι απέστειλαν 20 τριήρεις για να καταστείλουν την εξέγερση. Η Χίος για να αντιμετωπίσει αποτελεσματικά τους Αθηναίους προσπάθησε να προσεταιριστεί και άλλους συμμάχους , όπως τη Μίλητο, τη Λέσβο, τη Μήθυμνα  και προσχώρησε σε συμμαχία με τους Λακεδαιμόνιους , απ’ τους  οποίους και ζήτησε βοήθεια. Οι Αθηναίοι στράφηκαν πρώτα στη Χιακή ύπαιθρο  , έκαναν απόβαση στη Βολισσό και τα Καρδάμυλα, όπου νίκησαν και σκότωσαν πολλούς Χιώτες.  Οι Χιώτες νικήθηκαν και σε μάχες στα Φανά και στο Λευκώνιο και στη συνέχεια κλείσθηκαν στα τείχη της πόλης. Αργότερα καταφθάνει στη Χίο ο Πεδάριτος από την Σπάρτη με 500 μισθοφόρους , ο οποίος τη βρήκε σε άθλια κατάσταση.  Οι μισθοφόροι του Πεδάριτου διώχθηκαν από τους Αθηναίους οι οποίοι σκότωσαν και τον ίδιο τον Πεδάριτο. Στη συνέχεια οι Αθηναίοι πολιόρκησαν την πόλη της Χίου και έπεσε μεγάλος λιμός. Η σύμμαχος της Χίου Σπάρτη δεν απέστειλε  τότε κάποια βοήθεια. Έτσι οι Χιώτες αποφάσισαν να εξεγερθούν κατά των Αθηναίων μόνοι τους και επιτέθηκαν εναντίον  32 αθηναϊκών πλοίων με 36 δικά τους με αποτέλεσμα τη νίκη των Χιωτών.
Το 405 π.Χ. η συμβολή του χιώτικου ναυτικού στη ναυμαχία στους Αιγός Ποταμούς, ήταν σημαντική, αφού έκρινε τον πόλεμο και σηματοδότησε το τέλος της ενδοξότερης περιόδου της Αθήνας. Οι αρχηγοί του Χιακού στόλου τιμήθηκαν με αγάλματα  από το Λύσανδρο και τους συνεργάτες του. Ο Ισοκράτης σχολιάζοντας τα γεγονότα λέει επιγραμματικά: «για τη Χίο θα έλεγα ότι σε όποιον από τους δύο αντιπάλους προστεθεί, αυτός θα υπερίσχυε στη θάλασσα». Η φράση αυτή δείχνει το σημαντικό ρόλο της Χίου εκείνη την εποχή.
Η Χίος τα επόμενα χρόνια έμεινε στη συμμαχία της Σπάρτης και τη βοηθούσε με το στόλο της, ως το τέλος του πολέμου(404 π.Χ.).